指南&共识 ‖ 首篇tNGS（靶向测序）相关专家共识解读

相比分枝杆菌靶向测序，mNGS可检测出种类繁多的微生物，但无法实现对结核分枝杆菌耐药基因的全面检测。mNGS检测获得的常规数据量中特定微生物的序列数一般不足样本总序列数的5%，特异性序列覆盖度通常不到特定微生物基因组的1%，因此几乎不可能用于特定微生物的耐药基因突变分析。

2、应用高通量测序检测分枝杆菌的适应证

>tNGS

靶向测序适用于病原学阴性的疑似肺结核、肺外结核、NTM病的诊断及鉴别诊断，也适用于菌量丰富的临床标本或菌株的耐药基因突变检测，或用于分枝杆菌耐药的诊断。

>mNGS

mNGS适用于病原学阴性的疑似肺结核、肺外结核、NTM病及其他病原体感染的诊断及鉴别诊断。

3、适宜送检人群及时机

>tNGS

①疑似肺结核患者，具有典型的肺部影像学改变伴有或不伴有结核病中毒症状，常规的痰标本抗酸杆菌涂片、培养和GeneXpert等分子生物学检查均报告阴性结果时，或是有些患者增加了支气管肺泡灌洗液检查后仍不能确诊时。

②疑似结核性胸膜炎患者，具有典型的结核性胸膜炎的临床表现且胸腔积液为渗出液，未找到其他引起胸腔积液的原因，常规的抗酸杆菌涂片、培养和GeneXpert等分子生物学检查均报告阴性结果时。鉴于胸腔积液常规结核分枝杆菌检查阳性率低，可考虑尽早送检。

③疑似肺外结核患者如结核性脑膜炎、淋巴结结核、骨关节结核、结核性心包炎、肾结核、肠结核等，肺外结核诊断较困难，对应的临床标本中的分枝杆菌含量较低，常规检测灵敏度低，建议及早送检。

④复治结核患者，经过正规抗结核治疗但效果不理想，且常规的抗酸杆菌涂片、培养和GeneXpert等分子生物学检查均报告阴性结果，建议送检以明确耐药情况。

⑤疑似NTM病的患者，即多次培养及分子检测结果阴性者，尤其是同期抗酸杆菌涂片检查阳性的患者，建议送检。

⑥考虑为多种药物耐药的结核病或NTM病患者，建议及时送检以进一步获取多种药物的耐药证据，此时推荐送检菌量丰富的临床标本或菌株。

>mNGS

①疑似肺结核、结核性胸膜炎患者，常规的抗酸杆菌涂片、培养和GeneXpert等分子生物学检查均报告阴性结果，但仍需考虑与其他感染性疾病相鉴别的患者，建议送检。

②脑脊液常规检查及生物化学检查符合结核性脑膜炎的特点，脑脊液常规的抗酸杆菌涂片、培养、GeneXpert等分子生物学检查均报告阴性结果时，且患者无法排除其他感染，建议尽早送检。

③淋巴结、肺组织、肠黏膜组织等新鲜组织标本病理检查发现肉芽肿性病理改变但未查到结核相关证据，仍需考虑与其他疾病鉴别时，建议送检组织标本。

4、标本采集的一般注意事项

① 采集标本应尽量选择感染部位的体液或者新鲜组织送检，以提高检测的灵敏度。

② 应尽量在抗菌药物使用之前采集标本。

③ 不同类型的标本采集时需执行无菌操作，避免标本被污染。

④ 采样容器需明确标注样本类型及采集部位，并具有患者唯一识别信息，通常可包括检测编码、受检者的姓名、送检科室和住院号等信息。

⑤ 送检申请表需填写完整的受检者信息，包括标本唯一性编码、采样日期、采样时间、患者个人基本信息、标本组织类型、采样单位和临床资料等。

⑥ 医护人员在样本采集、运输和检测过程中需仔细核对患者信息。

5、结核病诊断

高通量测序检测结果中不同序列数的诊断意义：任何标本类型，如对同一微生物检出的拷贝数较高时（至少几百条序列），都可能有重要的临床意义。当开放性标本的序列数比较低，比如低于5条序列时，需审慎地判定其诊断价值。对于5～10条序列的结果,如果患者的症状、体征、疾病进程等临床表现也支持结核病的诊断，可以考虑采纳上述结果。而对于少于5条序列的结果，虽然已发表数据支持这一结果的诊断价值，但考虑到数据量太低有可能造成的误诊，建议除了要结合临床表现外，还可以考虑重复送检标本，或通过开展其他结核病的检测技术,对这一结果进行复核、确认。如果样本是无菌样本（脑脊液、血液）等，检出1条特异性序列也可以结合临床综合判定为阳性。

>mNGS 阳性阈值设定原则及判读标准：

阳性阈值的确定不依赖某个单一的指标，包括但不限于特定微生物的检出序列数（也常称为reads数）、归一化每百万序列（readspermillion, RPM）的比值、检出物种的基因组覆盖度、置信区间等。《宏基因组高通量测序技术应用于感染性疾病病原检测中国专家共识》建议，对于结核分枝杆菌等具有临床重要意义且较难检测的病原菌，检出1条特异性序列即可判定为阳性。鉴于检测的复杂性，本共识建议对获得个位数的序列需首先审核当前批次检测中有无其他获得大量序列支持结核病诊断的标本。若无此类标本，建议对测序所得序列进行置信区间评估，或行其他方法学进行佐证；若有此类标本，还需综合判断是否属于污染，可进行实时荧光定量PCR进行确认。若检测结果为阴性，具有一定排除感染的依据，但还需要结合临床综合判断。

>tNGS阳性阈值设定原则及判断标准：

由于靶向测序采用的是扩增分枝杆菌多靶点分类基因的方法，判断标准不同于mNGS检测。特异性序列大于100条序列，且非单一靶点序列，可推荐作为阳性阈值判定标准；特异性数据小于100条序列，特别是同批次有获得大量序列数可支持结核病诊断的标本时，需行其他方法学进行佐证，可进行实时荧光定量PCR确认。特异性数据小于10条序列时，尤当慎重判读，建议考虑另留取一份样本进行检测以佐证本次检测结果。如重复样本获得阳性结果，无论序列数如何，都应首先考虑其结核病诊断；如果复测结果为阴性，则暂不考虑其结核病诊断。

6、NTM诊断

高通量测序对NTM 病的诊断价值与对结核病的诊断价值有类似之处，如检测技术的类型、标本的类型及序列数等。但高通量测序检测到NTM的核酸又与检测到结核分枝杆菌的核酸存在明显不同的价值，这种不同主要是因为NTM并非像结核分枝杆菌一样属于绝对致病菌。除了海分枝杆菌和溃疡分枝杆菌外，NTM都属于机会致病菌，可在机体中定植而不引起疾病，因此需要依照指南推荐的判断标准，仔细辨别其是否是引起感染的病原菌。有些NTM菌种在环境中普遍存在，即便多次以不同的方法检测到，仍应该审慎地判断其临床相关性。

① 高通量测序检测结果回报为常见的致病性NTM菌种：临床由NTM导致的感染越来越常见。已经报道的NTM菌种/亚种已超过200种，但能够致病的仅有几十种，而临床常见的致病性NTM的菌种数量仅为个位数。根据来自国内的数据，临床常分离到的菌种主要包括：胞内分枝杆菌、鸟分枝杆菌、脓肿分枝杆菌、龟分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、偶发分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、戈登分枝杆菌等。上述分枝杆菌与临床的相关性并不一致。我国常见的NTM菌种中，临床相关性较好的有胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌和脓肿分枝杆菌，其次是鸟分枝杆菌。有些常被分离的菌种如戈登分枝杆菌、偶发分枝杆菌、土地分枝杆菌，在环境中普遍存在，致病概率并不高。高通量测序检测阳性等同于1次分子检测阳性，因此需要至少再有1份标本的检测鉴定结果为同一菌种时才可考虑其临床意义。需要注意的是，不同地区菌种的临床相关性可能存在差异，如我国北方地区与南方地区相比，分离到NTM的概率相对较低，但临床相关性却高于南方地区。另外，综合医院分离的NTM的临床相关性要弱于结核病专科医院。在就诊时，综合医院常是患者就诊的首选，而患者到专科医院就诊时多经过了综合医院的初筛，所以更可能患有NTM病。

② 高通量测序检测结果回报为罕见的NTM菌种：一般而言，关于这些罕见菌种致病的病例报道特别少见，甚至检索不到，且这些罕见菌种也不是环境中常能够分离到的菌种。在目前情况下，比较稳妥的处理原则是不优先考虑这些罕见分枝杆菌菌种为致病菌。只有在2次高通量测序鉴定为同一种NTM时，在充分考虑鉴定微生物的致病性和序列数，且结合患者的临床表现、治疗反应，以排除法将可能不致病的微生物逐一排除后，才适当考虑这些罕见分枝杆菌菌种致病的可能。同时，需关注患者是否有较严重的免疫性疾病或其他免疫抑制因素，因免疫抑制常对患者发生罕见的NTM感染有促进作用。

7、分枝杆菌病的耐药诊断

>mNGS

mNGS技术通常无法获得足够的结核分枝杆菌/NTM的核酸序列信息，因此不用于分枝杆菌耐药的诊断。即便获得数据中包括了耐药基因的数据，但由于数据量偏低，考虑到患者体内菌群可能存在异质性的问题，所以少量数据可能无法准确反映患者体内菌群的真实组成情况。

>tNGS

靶向测序通过特定的捕获技术对标本中结核分枝杆菌/NTM核酸及耐药基因进行富集，以提高核酸浓度，获得更多的数据信息。当临床标本中菌含量丰富时，能捕获到数量较多的不同耐药基因的序列，从而进行耐药的分子诊断。当样本中菌量较少时，捕获到的不同耐药基因的序列数可能会较少，此时虽然可以依据序列信息判定细菌是否耐药，但结果的可靠性大幅降低。

此外，即便是同一标本，检测到的不同耐药基因的序列数量差异也可能非常显著，对于检测到序列数量偏低的耐药基因，其结果判定的可信性大幅降低。当使用菌株作为检测标本时，可以方便地获得所关注的目的基因，通过高通量测序反应，获得多个耐药基因的序列信息。

为了更好地满足临床感染诊断需求，星云基因推出了两款病原体靶向高通量检测产品——“星思明·呼吸道病原体靶向高通量检测”和“星易明·病原体靶向高通量检测”。通过超多重PCR富集目标病原，提升检测灵敏度，同时排除人基因组及背景微生物基因组的干扰，大幅提升对结核、真菌、胞内菌、RNA病毒等难检测病原体的检测率。覆盖临床感染常见的病原体、耐药基因和毒力基因，适用于临床感染患者的辅助诊断。

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